ขั้นตอนการผลิตโมโนโคลนัล แอนติบอดี

1. การเตรียมแอนติเจนที่ใช้ ควรเตรียมแอนติเจนให้มีความบริสุทธิ์มากที่สุด เพื่อกระตุ้นให้สัตว์ทดลองสร้างแอนติบอดีต่อสิ่งที่ต้องการ และสามารถ Characterized โมโนโคลนัลแอนติบอดี ที่สร้างได้แล้ว ว่ามีความจำเพาะต่อส่วนใดของแอนติเจน และควรเตรียมแอนติเจนให้เพียงพอที่จะฉีดกระตุ้นให้สัตว์ทดลองและนำมาใช้ Soreening test และขั้นตอน Charecterization

2. การ Screening test โมโนโคลนัล แอนติบอดีในส่วนน้ำใสของอาหารเพาะเลี้ยงเซลล์นั้น จะมีปริมาณต่ำมากในระดับ nanogram ถึง microgram/ml ดังนั้น Screening test เพื่อใช้ตรวจหา specific monoclonal antibody ต่อแอนติเจนที่ต้องการ ต้องมีความไวสูง test ที่ใช้ได้แก่ ELISA หรือ RIA test

3. การฉีดกระตุ้นสัตว์ทดลอง แอนติเจนที่ใช้กระตุ้นหนู BALB/c มักนิยมผสมใน complete freund adjuvant (CFA) ผสมให้เข้ากันจนเป็น water in oil emulsion เพื่อให้หนูสร้างแอนติบอดีต่อแอนติเจนได้ดีขึ้น ตำแหน่งที่ฉีกทางช่องใต้ผิวหนังหรือ ชั้น subcutaneous injection อาจมีการฉีดซ้ำภายหลังฉีดครั้งแรก 1,2 หรือ 4 อาทิตย์ แล้วแต่การเลือกวิธีการฉีด ทดลองเจาะเลือดจากข้างเป้าตาหรือจากหาง เพื่อหาระดับของแอนติบอดีที่ต้องการใน screening test ที่มีอยู่แล้ว ถ้าระดับไตเตอร์สูงมากจะมีโอกาสได้ clone cell สูงด้วยเช่นกัน ก่อนฆ่าหนูเพื่อนำ spleen cell มาใช้ต้องกระตุ้น (booster sose) โดยละลายแอนติเจนในน้ำเกลือแล้วฉีดเข้าเส้นเลือดทางหาง หรือเข้าช่องท้องก่อนวันที่จะฆ่าหนูเพื่อใช้ม้าม 3 วัน

4. การเตรียม Myeloma cell Myeloma cell ส่วนใหญ่ใช้ P3-X63-Ag-8.653 เลี้ยงใน Tissue culture flask ขนาด 250 ml โดยเซลล์จะต้องไม่มี contamination จากเชื้อรา หรืแบคทีเรียและมีจำนวนของเซลล์ที่ชีวิต (viable cell) ไม่ต่ำกว่า 90% เมื่อนับด้วยสี trypan blue

5. การเตรียม HAT medium ผสม HAT ในความเข้มข้นที่ต้องการลงในอาหารเลี้ยงเซลล์ คือ PRMI 1640 หรือ DMEM ที่มี 10% fetla calf serum โดย HAT medium นั้นจะต้องไม่มี contamination จากเชื้อราหรือแบคทีเรีย และสามรรถหยุดการเจริญเติบโตของ myeloma cell ได้ด้วย

6. การเตรียม feeder cells Feeder cells ที่นิยมใช้เป็นส่วนใหญ่เป็นเซลล์ macrophage จากช่องท้องหนู Feeder cell จะช่วยขจัดซากของเซลล์ที่ตายแล้ว โดยการ phagocytosis และขณะเดียวกันจะปล่อย growth factor ออกมาทำให้ hybridoma cell โตเร็วขึ้น การเตรียม feeder cell ทำได้โดยฆ่าหนู แล้วเปิดช่องท้องให้คงเหลือเยื่อบุช่องท้องคลุมอยู่ แล้วจึงฉีด RPM-1640 ที่เย็นจัด (4ฐC) เข้าไปในช่องท้อง แล้วดูดออกมาโดยไม่มีอุจจาระในลำไส้ของหนูปนเปื้อนมาด้วย นำเซลล์ที่ได้มากปั่นล้างด้วย RPMI-1640 อีก 1 ครั้งแล้วจึงใส่ Feeder cell ลงใน HAT medium

7. การทำ Cell fusion เมื่อสิ่งที่เตรียมไว้พร้อมแล้ว จึงเตรียมการ fuse spleen cell กับ myeloma cell ด้วยสาร polyethylene glycol โดยมีขั้นตอนดังนี้
 

7.1 เตรียม fusing medium นำ polyethylene glycol (PEG) ไป sterile ด้วยวิธี autoclave แล้วอุ่นที่อุณหภูมิ 56C จะหลอมละลายเป็นของแหลว นำไปปสมกับ RPMI 1640 และ DMSO ให้มีความเข้มข้นของ 40% PEG และ 10% DMSO ใน RPMI 1640 นำไปอุ่นที่ 37ฐC ก่อนใช้

7.2 เตรียม myeloma cell suspension นำ myeloma cell จาก flask 250 ml ออกมาปั่นล้างด้วย RPMI 1640 จากนั้นจึง resuspend ใน RPMI 1640 ประมาณ 10 ml เพื่อนับจำนวนเซลล์และนับเป็น viable cell ด้วยสี trypan blue

7.3 เตรียม spleen cell suspension ฆ่าหนูด้วยวิธีดึงคอ (cervical dislocation) แล้วเปิดหน้าท้องด้วยวิธี aseptic technique ดึงม้ามออกมาบดบนตะแกรงลวดตาถี่ นำ spleen cell ที่ผ่านตะแกรงลวดมาปั่นล้างใน RPMI cells และนำ vialble cell ด้วยสี trypan blue

7.4 Fusion ผสม spleen cell suspension และ myeloma cell suspension ในอัตราส่วน spleen cell ต่อ myeloma cell = 5:1 (ซึ่งบาง lab อาจใช้ถึง 10:1 หรือ 20:1 ก็ได้) แล้วนำไปปั่น 1800 rpm เป็นเวลา 5 นาที เทน้ำทิ้งแล้วเติม fusing medium ลงไป 1 ml ผสมให้เข้ากันเป็นเวลา 1 นาที แล้วจึงเจือจางด้วย RPMI 1640 30 ml ปั่น 1800 rpm 5 นาที เทน้ำใสทิ้งแล้ว resuspend ใน HAT medium จากนั้นจึงนำ Cell suspension ไปเพาะเลี้ยงใน HAT medium ที่มี feeder cells ต่อไป

8. การทำ screening test เพื่อคัดเลือก Hybridoma clone ที่ต้องการ ภายหลังจาก fuse cell ทั้ง 2 ชนิดประมาณ 10-14 วัน Myeloma cell ที่ไม่ได้หลอมรวมกับ spleen cells จะตายไปจากฤทธิ์ของ aminopterin ที่อยู่ใน HAT medium นั้น ขณะเดียวกัน spleen cell ที่ไม่ได้หลอมรวมกับ myeloma cell จะตายไปเอง เซลล์ที่มีชีวิตอยู่ใน HAT medium จะเป็น hybridoma cell เท่านั้น ซึ่งจะแบ่งตัวเป็น colony มองเห็นได้ด้วยตาเปล่าจากนั้นจึงนำส่วนน้ำเลี้ยงไปตรวจหา specific monoclonal antibody ต่อแอนติเจนที่ต้องการด้วยวิธี ELISA หรือ RIA ที่เตรียมไว้แล้ว ถ้าหลุมใดให้ผลบวกจึง Transfer colony นั้นไปเลี้ยงต่อใน HAT medium เพื่อเพิ่มจำนวนให้มากขึ้น

9. การทำ Cell cloning ภายหลังจากได้ colony ที่สร้างโมโนโคลนัล แอนติบอดีที่ต้องการแล้ว อาจมี colony อื่น ที่ไม่ได้สร้างแอนติบอดีที่ต้องการติดปนมาด้วย ต้องคัดเลือกเอาเฉพาะ pure colony เท่านั้นโดยใช้วิธี limiting Dilution Technique โดยการเจือจางเซลล์ให้มีความเข้มข้นที่ต้องการแล้วเพาะเลี้ยงลงใน tissue culture plate ชนิด 96 หลุม โดยให้ความเข้มข้นของเซลล์แต่ละหลุมมีปริมาณ 50,20,10,5,2,1,0.5 และ 0.25 cell ต่อหลุม ตามลำดับ (ความเข้มข้น 0.5 และ 0.25 cell/well เป็นค่าที่จะได้จากการคำนวณ และโอกาสที่จะเกิดขึ้นจะกระจายตามค่าทางสถิติของปัวซองต์) แล้วเพาะเลี้ยงไว้นานประมาณ 10-15 วัน เลือก colony ที่เกิดขึ้นจากหลุม ในความเข้มข้น 1 cell/well และให้ผลยวกกับการ screening test ด้วยวิธี ELISA จึงเก็บเองสายพันธุ์นั้นมาเพาะเลี้ยงและเพิ่มจำนวนต่อไป

10. การเก็บเซลล์ hybridoma หลังจากได้ Hybridoma clone ที่ต้องการแล้ว ส่วนหนึ่งต้องเก็บแช่แข็งเพื่อสต๊อกไปใช้ในอนาคต โดยนำ Hybridoma clone นั้นมา resuspend ใน freezing medium แล้วแช่ freeze ใน -70ฐC ค้างคืนแล้ว transfer ใส liquid nitrogen tank ต่อไป ถ้าต้องการใช้สายพันธุ์ที่แช่แข็งนั้น ก็สามารถละลายนำกลับมาเพาะเลี้ยงได้อีก โดยนำสต๊อกเซลล์ที่แช่แข็งนั้นมาละลายอย่างรวดเร็วแล้วปั่นล้างด้วย RPMI-1640 ด้วยน้ำเลี้ยงเซลล์ นำไปเพาะเลี้ยงต่อไป เซลล์ที่มีชีวิตเหลือรอดอยู่จะเจริญเติบโตและแบ่งตัวเพิ่มจำนวนขึ้นมาใหม่

11. การเพิ่มความเข้มข้นของ Mabs และการทำให้ Mabs บริสุทธ์ โมโนโคลนัล แอนติบอดี ที่มีอยู่ในส่วนน้ำใสของเซลล์ที่เพาะเลี้ยงนั้น จะมีความเข้มข้นต่ำในระดับ microgram/ml ซึ่งในบางกรณีความเข้มข้นน้อยเกินไปที่จะนำไปใช้งาน ดังนั้นจึงต้องเพิ่มความเข้มข้นขึ้นโดยวิธีการต่างๆ ทางชีวเคมี หรือทำการเพาะเลี้ยงแบบ suspension culture อีกวิธีการหนึ่งก็คือการนำ Hybridoma cell suspension ที่ต้องการฉีดเข้าช่องท้องของหนู Balb/c ที่ถูกฉีดกระตุ้นด้วยสารชื่อ prista ไว้ก่อนแล้ว 1-2 สัปดาห์ รอจนหนูเกิดท้องนานแล้วจึงเจาะเก็บ ascitic fluid ทางช่องท้องนั้นออกมา MABs ที่มีอยู่ในน้ำสในช่องท้องนั้นจะมีความเข้มข้นสูงขึ้นในระดับ mg/ml Mabs ที่ทำการเพิ่มความเข้มข้นแล้วสามารถทำให้บริสุทธิ์ขึ้นโดยวิธีการทางชีวเคมีเช่น การทำโครมาโตกราฟฟี่โดยวิธีการต่างๆ ก่อนที่จะนำไปใช้งานต่อไป การนำ monoclonal antibodies ไปใช้ประโยชน์ การที่ Mabs มีประโยชน์อย่างมากก็เพราะมีความจำเพาะอย่างสูงต่อ antigenic determinant หนึ่งๆ ของแอนติเจนทีใช้ฉีดกระตุ้น ทำให้สามารถนำไปใช้ในการทำปฏิกิริยาทาง immunoassays ทั่วๆ ไป ซึ่งทำให้มีความไว (sensitivity) ในการทดสอบสูงขึ้นกว่าเดิมมากโดยที่ถ้าเลือก Mabs ที่เหมาะสมมาใช้งาน คือมี affinity สูงและไม่มี cross reaction ก็จะทำให้ประหยัดเวลาและแรงงานในการนำไปใช้งาน นอกจากนั้น MABs ก็สามารถผลิตขึ้นมาได้ไม่จำกัดจำนวน มีคุณสมบัติสม่ำเสมอในการเพาะเลี้ยงในห้องปฏิบักติการ ซึ่งถ้าคิดในระยะยาวก็เป็นการคุ้มค่าแก่การลงทุน แม้จะมีราคาแพงบ้างในการผลิตโดยเฉพาะในตอนเริ่มต้น